南京境福环保科技有限公司
全国统一客服热线

18625155131

1
新闻科普

NEWS CLASS

境福服务

PRODUCT CLASS

地址:

南京市玄武区中山路178号

手机:

18625155131
新闻科普

当前位置:首页 > 新闻科普

甲醛如何与氨基酸反应

文章作者:    时间:2020/11/6 13:37:48

甲醛如何与氨基酸反应.pdf

引言

甲醛是通过包括酶促脱甲基化在内的过程产生的生物亲电试剂。尽管表面上很简单,但甲醛与基本生物成分的反应仍未完全确定。在这里,我们报告基于NMR的甲醛与常见蛋白原和其他亲核氨基酸反应的研究。结果表明甲醛以不同的速率反应,形成具有不同稳定性的羟甲基化,环化,交联或歧化的产物。在测试的常见氨基酸中,半胱氨酸反应最有效,形成稳定的噻唑烷。与赖氨酸的反应效率较低。低水平的观察到甲基化产物,增加了甲醛进行非酶促赖氨酸甲基化的可能性。与甲醛的反应比与其他经过测试的生物羰基化合物的反应要快,并且加合物也更稳定。结果显示甲醛与氨基酸的反应,以及延伸肽和蛋白质的反应,在健康和患病的生物学以及进化中具有潜在作用。

介绍

甲醛(HCHO),最简单的醛,存在于血液,细胞间组织和细胞内。外源性HCHO来源,包括药物(包括前体药物),化妆品,纸,家具,香烟烟雾,胶合板和食品。通过涉及氨基脲敏感性胺氧化酶的酶催化的反应产生内源性细胞HCHO生产,丝氨酸hydroxymethyltransferases ,二甲基甘氨酸脱氢酶,脂质过氧化物酶,P450氧化酶和ñ -甲基组脱甲基酶。最近的工作还表明,HCHO参与叶酸代谢。超过阈值水平,HCHO对人类表现出毒性,急性HCHO暴露与疼痛,皮炎,恶心,心律不齐,昏迷和肾衰竭;长期接触会增加患癌症的风险。小鼠研究表明,受损的HCHO代谢与器官功能障碍,骨髓衰竭,白血病和肝癌之间存在相关性。在范科尼贫血模型中,受损的HCHO代谢具有致死性,该疾病的特征是DNA损伤修复的缺陷。

从化学角度看,HCHO(未水合形式)是一种强效亲电试剂,可与蛋白质和DNA中的生物亲核试剂反应。据报道,有利于HCHO在体外形成的链内和DNA-蛋白质交联。HCHO在细胞中的相关反应可能是其毒性/致癌作用的原因,尽管此类反应的确切化学性质及其细胞普遍性尚不清楚。鉴于HCHO是内源性产生的,因此它或其加合物可能在氧化还原代谢中起传感或调节作用。此类角色可能包括动态调节生物分子之间的相互作用,和/或形成核酸和相关蛋白的功能重要的加合物.

为了更好地了解HCHO及其衍生物如何影响健康和疾病中的细胞功能,重要的是确定其与生物分子的反应。希佩尔和梅巨泰与HCHO核苷/核苷酸的反应率先研究; 这些中,更近期的工作一起,显示与核碱基HCHO的反应速率的实质差异,而在HCHO核碱基加合物的稳定性(包括当被酶促氧化产生Ñ甲基基团)。

继在20世纪20年代创举,许多研究已经报告了HCHO的与氨基酸(AAS)的反应和肽。然而,关于HCHO与氨基酸反应的详细系统研究报道很少。从最近的工作继调查一些HCHO与精氨酸,赖氨酸和短肽反应的产品,我们报告了HCHO与常见蛋白原性和其他生物学相关AA反应的系统核磁共振(NMR)研究。结果表明,HCHO在一定条件下会与不同的AA反应,从而产生稳定性非常不同的羟甲基化,环化,N-甲基化和N-甲酰化产物。将HCHO与其他经过测试的生物学上相关的醛/酮的反应进行比较,表明HCHO反应最快,通常形成最稳定的产物。结果突出表明,HCHO衍生的加合物可能参与健康的生物学,疾病和进化。

结果

AA和HCHO反应中的产物鉴定

最初,我们研究了HCHO与以下常见的蛋白质AA的反应:丙氨酸(Ala),半胱氨酸(Cys),丝氨酸(Ser),苏氨酸(Thr),高半胱氨酸(Hcy),青霉胺(Pen),高丝氨酸(Hse),同种异体-苏氨酸(同种异体-Thr),赖氨酸(Lys),鸟氨酸(Orn)的氨基酸,精氨酸(Arg),组氨酸(His),色氨酸(trp),酪氨酸(酪氨酸),天冬酰胺(ASN),谷氨酰胺(Gln),ñ ε -methyllysine(赖氨酸(Me)中),ñ εñ ε -dimethyllysine(赖氨酸(ME)2),5-羟基赖氨酸(5hLys)和脯氨酸(Pro)。在d标准反应条件包括AA(4.34毫摩尔)与甲醛(10个当量)2 O.反应是通过在48小时监测11 H NMR。

所研究的最具活性的蛋白质氨基酸是Cys,其产生的噻唑烷1“热力学”产物(图 1,黑色圆圈),半硫缩醛2为明显的“动力学”产物(图 1,白色菱形和图 2)。(1))。硫代半缩醛的观察2在酸性条件下被相对延长(DCL,2当量),并可能涉及增加Ñ α氨基质子化。在升高的温度(308和318 K)和添加碱(NaOD,1当量)的条件下,环化生成噻唑烷1的能力增强。与高半胱氨酸(Hcy)观察到相似的反应活性,得到环噻嗪烷3作为热力学产物,半硫缩醛4作为动力学产物(图 2(2))。Cys类似物青霉素胺(Pen)与HCHO的反应给出了噻唑烷5,以及羟甲基化硫醇6的动力学形成。稳定半缩醛胺型加成物或亚胺没有直接通过与HCHO的反应的检测限内观察到Ñ αCys /半胱氨酸/笔-基团,或与任何测试的AA的; 但是,半硫缩醛2 / 4/6可能不是形成1 / 3/5的中间体(见下文)。

图1image.png

半胱氨酸与甲醛(HCHO)之间的反应。HCHO与半胱氨酸反应生成半硫缩醛和噻唑烷产物。一个半胱氨酸的反应(4.34毫米,白色圆圈)与HCHO(2当量)在标准条件下,通过监测1随着时间的推移H NMR,揭示了形成硫代半缩醛2(白色菱形)和噻唑烷1(黑色圆圈)的形成b在标准条件下以不同的pD值(6、7.5和9)监测半胱氨酸(4.34 mM)与HCHO(10当量)的反应

全尺寸图片2

image.png

HCHO与巯基/含醇氨基酸的反应产物。半胱氨酸,高半胱氨酸,青霉胺,丝氨酸,苏氨酸,异基因-苏氨酸,高丝氨酸,天冬酰胺和谷氨酰胺被允许与过量HCHO发生反应,在非缓冲d 2 O(570微升)。一个氨基酸(4.34毫摩尔),甲醛(10个当量); b氨基酸(43.4 mM),HCHO(10当量); (I)要求添加碱(NaOD,1当量);(II)通过添加碱(NaOD,1当量)并以更高的浓度(43.4 mM氨基酸和HCHO)加速

全尺寸图片

在我们的标准条件下,Ser和HCHO之间的初始反应未获得形成产物的直接证据。但是,在添加碱(NaOD,1当量)时,发现了新的1 H宽共振峰,这表明形成了与Ser起始物料平衡的亚稳态产物。该产物被命名为恶唑烷7(图 2(4)),其结构等同于噻唑烷。的较慢形成速率7选自Ser,相对于的1从的Cys,用serinyl羟基(在13.4预测的更高的pKa值相关因素(ACD / I-实验室,5.0.0.184,高级化学开发公司,加拿大安大略省多伦多市,www.acdlabs.com(2019))与半胱氨酸硫醇组(8.4(AAs和酸度值,http: //academics.keene.edu/rblatchly/Chem220/hand/npaa/aawpka.htm,(访问1 (2019年5月)),表明羟基/硫醇去质子化可能是(部分)限速.未反应的Ser和7之间明显的快速相互转化(如其扩大的1 H共振所示)通过冷却(278 K)而减慢了,这使得结构分配7(补充图 1)。使用定量1 H NMR对碱性条件下潜在的立体化学纯度损失进行研究,结果表明在H处没有2 H的结合(<2%)。ħ α位置,这意味着立体化学的维护(补充图 2)。

Ser相比,Thr和HCHO之间的反应导致在标准条件下(即不添加碱的情况下)观察到恶唑烷8(图 2(5))。但是,通过添加碱(NaOD,1当量)可加速转化为8,并且浓度依赖性。因此,Thr仲醇和Ser伯醇之间的细微差别似乎足以促进Thr形成8,这可能是由于Thorpe-Ingold效应和/或恶唑烷产品稳定性的提高(87)。与苏氨酸差向异构体HCHO反应异基因-苏给唑烷9(图 2(6)),但反应效率不如Thr。该观察结果可能反映了顺式取代的恶唑烷环9中存在空间冲突。

在高丝氨酸(Hse)中加入HCHO后,形成了1,3-恶嗪烷10(图 2(7))。反应10在不存在酸或碱的观察,表明在形成1,3-恶嗪烷的比形成的1,3-恶唑烷用Ser,Thr或更高效的异体-Thr。但是,要完全转换为10,需要添加碱。

Asn和Gln与HCHO的反应比与Cys,Hcy,Pen,Ser,Thr,allo - Thr或Hse的反应慢得多。在48小时内,Asn和Gln与HCHO反应分别形成内酰胺1160%)和1412%)(图 2(8/9))。在更浓缩的条件下,通过加热或添加碱,可加速至1114的环化。在更高浓度的条件下(43 mM Asn; 10当量的HCHO)在Asn和HCHO之间进行反应导致进一步的羟甲基化,形成N-羟甲基化的内酰胺1213(图 2)。 (8)).

在标准条件下,他观察到经历快速反应与HCHO以形成环化Ñ π -和Ñ α -bridged化合物17<20分钟,图 3(1))。在较高的浓度下,咪唑环的羟甲基化迅速发生,形成151624小时后,将随后形成CN α -环化分子spinacine(19),一种天然产物存在于许多食物时,观察到。19的形成,可能比17稳定,与降低17水平有关。19的形成随着碱的添加而增加;然而,在碱性条件下也观察到了另一种羟甲基化产物20

3

image.png

HCHO与芳香族氨基酸反应的产物。组氨酸和色氨酸与HCHO在非缓冲D 2 O(570 µL)中过量反应。一个氨基酸(4.34毫摩尔),甲醛(10个当量); b氨基酸(43.4 mM),HCHO(10当量); (I)在碱性条件(NaOD,1当量)和更高浓度(43.4 mM氨基酸)下加速;(II)在酸性条件下(DCl,1当量)促进产物的形成

全尺寸图片

Trp与HCHO的反应导致最初的吲哚环N-羟甲基化,得到21。随着时间的推移,Ç - ñ α环化随后观察到,得到22(图 3(2))。加入酸(DCl,1当量)抑制了对21的观察并促进了22的形成;加入NaOD(1个当量)的促进形成的21以上22。吲哚氮进一步的N-羟甲基化22生成23,这在Trp与HCHO在强酸性条件下的反应中已有报道(图 3(2)).

在标准条件下将Arg溶解后,可获得中等碱性的溶液(pH 9);与HCHO的反应导致观察到1,6,8-三氮杂双环癸烷24,大概是通过瞬态环状中间体25(图 4(1))观察到的,最初是在较低浓度下观察到的。Arg浓度增加(至43.4 mM)导致观察到其他低水平的1 H共振,这可能与无环半胱氨酸相对应,如先前所述。

4

image.png

HCHO与含侧链胺的氨基酸反应的产物。使精氨酸,赖氨酸,5-羟基赖氨酸和鸟氨酸与HCHO在非缓冲D 2 O(570 µL)中过量反应。一个氨基酸(4.34毫摩尔),甲醛(10个当量); b氨基酸(43.4 mM),HCHO(10当量),碱(NaOD,1当量); c氨基酸(4.34mM),HCHO(10当量),碱(NaOD,1当量);d氨基酸(4.34 mM),碱(NaOD,1当量);(I)以较低浓度(4.34 mM)和有限的HCHO(1当量)存在; (II)以较高的浓度(43.4 mM)和有限的HCHO(1当量)存在;(III)仅在碱性条件下(pD 9)转化,而在更高浓度下(43.4 mM)会形成更多的产物;(IV)信号扩大导致无法完全分配

全尺寸图片

使用Orn,仅在添加1当量的NaOD时观察到反应。在早期时间点(5分钟),唯一观察到的产物是环状氨醛2626大概是通过中间缩醛29形成的,这是在将Orn暴露于化学计量的HCHO时观察到的(图 4(2))。在高Orn浓度(43.4 mM)下添加一当量的HCHO,导致形成2931%)和一个新物种,该物种被指定为二聚体动物醛3027%)。在较低的Orn浓度(4.34 mM)下,观察到29种是主要产物(56%)。有趣的是,长时间培养Orn(43.4 mM)和HCHO(24小时内10个当量)会产生N6-甲酰基-N 1-甲基和1-甲酰基-N 6-甲基加合物2728(图 4(2));没有观察到二甲酰化或二甲基化的物种,这表明2728是通过26的分子内歧化形成的(很可能是通过分子内的氢化物移位,如先前提出的与较简单的烷基二胺(图 5a)的类似反应)。48公顷后,一小部分(约5%)的2728失去了桥连的亚甲基,提供了歧化产物的线性形式,分别为3132。几天后观察到足够的3132水平用于表征。Orn的观察结果表明,在HCHO与简单AA反应中,可能产生复杂而动态的结果。

5

image.png

HCHO与赖氨酸或鸟氨酸反应的可能机理和pH曲线。a在碱性条件下(鸟氨酸(4.34 mM),HCHO(10当量)在碱(NaOD,1当量)存在下)从26(图 4)形成2728的可能机制。(b)鸟氨酸(43.4 mM)和HCHO(10当量)在不同pH值下反应的1 H NMR时间进程; 通过峰积分确定浓度并参考原始鸟氨酸浓度。 c通过亚胺33b形成33的可能的轮廓机理

全尺寸图片

如利用Orn,赖氨酸仅与HCHO反应以形成在碱性条件(NaOD,1个当量)下检测产物,形成的低水平的Ñ ε -甲基赖氨酸33<5%,图 4(3),补充图 143 - 146)。为了形成N个没有证据α甲基化的产物累积。与Orn相反,Lys未观察到环状或甲酰化产物,这表明当AA侧链长度从3个亚甲基增加至4个亚甲基时,此类物质的形成受到不利影响。

然后,我们探索了HCHO与5-羟基赖氨酸(5hLys,4.34 mM)的反应,该反应是通过胶原蛋白和其他蛋白质的翻译后修饰产生的(图4(4))。在中性或酸性条件下,与HCHO(10当量)未观察到任何反应。然而,在碱的作用下出现了新的广泛共振(1当量的NaOD,补充图3)。尽管可以通过化学位移分析(δH为3.02和2.41 ppm,分别对34个C6-亚甲基的非对映体质子进行试探性分配(分别为δH 3.02和2.41 ppm,补充图4),但新共振的广泛性质妨碍了产品表征。 和5)。这两个共振与δH 3.61 ppm处的单个加宽共振具有COZY相关性,该共振被暂时分配给与C5相连的质子。HMBC分析使用13 C标记的HCHO在δ揭示三个共振和碳共振之间的相关性Ç 83 ppm时,有可能指示恶唑烷34。因此,如用Ser / Thr / allo -Thr所观察到的,可用数据共同暗示在34中恶唑烷环的形成。共振的广泛性质表明在测试条件下具有高度的可逆性。

Tyr和HCHO之间未发现可检测到的反应。但是,以前的报告表明,肽中的Tyr残基可以与HCHO和Gly反应形成桥连的Tyr-CH 2 -Gly加合物,并且在蛋白质晶体结构50中观察到HCHO介导的亚甲基桥连的Tyr-Gly交联。在HCHO与Ala或Pro之间未观察到产生稳定产物的反应。这些观察结果暗示,至少在我们的条件下,α-氨基基团反应以生成NMR可检测产物需要其他侧链基团的参与。

pH和浓度依赖性研究

然后,研究集中于研究改变AA浓度和pH值的影响。在添加HCHO(10当量)之前,先对含有4.34或43.4 mM AA的样品进行NMR分析,然后将其预先调节至pD 6、7.5或9,并进行长达48小时的监测。Cys和Hcy在所有三个pH和两个浓度下均与HCHO快速反应,在一小时内分别形成噻唑烷13(补充表 1(1/2))。注意,在不存在HCHO的情况下,观察到了二硫化物的形成。因此,HCHO具有调节细胞中硫醇/二硫键平衡的潜力。Ser,Thr,allo -Thr和Hse也反应形成环状产物(7 – 10),但效率不如Cys,在20分钟内达到平衡。在所有情况下,在较高的AA和HCHO浓度和pD 9下,环化作用都更大(补充表 1(1-6),0-86%)。当Asn和Gln与HCHO反应时,观察到缓慢转化生成内酰胺111448小时后,在两种AA浓度下,在更碱性的条件下观察到羟甲基化内酰胺1213(补充表 1(7/8))。在较低的His浓度和较低的pH(pD = 6)下,优选通过His与HCHO反应形成17。在基本条件下,C–N环化产品更为普遍,有19种20在物pD 9 48小时(补充表后观察到 19))。对于Trp,在较低的Trp浓度下,羟甲基化加合物21是观察到的主要产物。在较高的Trp浓度下,在48小时后观察到几乎完全形成环化产物2223(补充表 1(10))。在测试的AA浓度和整个测试的pH范围内,Arg和Lys基本上都没有反应。唯一可检测到的带有Arg的产物是24,仅在48小时后的pD 9观察到(分别为12%和23%(分别为4.34和43.4 mM的AA),补充表 1(11))。与赖氨酸,痕量形成Ñ ε甲基化的产物33中观察到(图 5C); 在第48天(43.4 mM AA)的第9天,有证据表明可能形成另一种先前未发现的加合物(在6.8 ppm时发生1 H共振),可能是由亚胺或半胱氨酸引起的(33b,图 5c);但是,由于该物种的浓度低,无法对其进行全面表征(补充表 1(12),补充图 143 – 146)。与HCHO的反应中未观察到进一步的甲基化Ñ ε -methyllysine(赖氨酸(Me)中)或ñ εÑ ε -二甲基赖氨酸(Lys(Me)2)历时48小时(43.4 mM AA,10当量的HCHO,pD 9)。在第9天将Orn暴露于HCHO时,观察到2728的两个N-甲酰酰胺构象异构体。2728的形成似乎在较高的Orn(43.4 mM)和HCHO浓度以及较高的pH值下加速(pD 9;图 5b)。

为了进一步研究pH对恶唑烷和恶嗪酮形成的影响,我们在不同pH(25 mM磷酸盐缓冲液pD)下与HCHO(10当量)与Ser,Thr,Hse和5hLys(4.34 mM,补充图6 – 11)进行了反应。  6.4、7.0、8.0、9.0、9.8、11.0和12.0)。在分析之前使反应平衡。在碱性条件下,恶唑烷/恶嗪烷的形成更为普遍。对于Ser,在pD 12(> 50%转化)时,恶唑烷7的形成在样品中最为显着,而Thr衍生的恶唑烷8pD 8相当普遍。 20当量的HCHO(补充图 10),表明HCHO浓度已饱和。相比之下,在pD 7处观察到Hse和HCHO形成恶嗪烷10> 50%转化率)的反应,这表明在中性pH下恶嗪烷的形成比恶唑烷的形成更有利。观察到的HCHO与5hLys的反应在pD 12时最为显着(补充图 9)。这种反应性与用Ser观察到的相似。最后,在具有Thr或allo - Thr的样品中未观察到反应性的显着差异(在2.5mM,补充图 11)。

用于体内HCHO浓度已报道的各种值1可能反映在测量的反应性亲电子的浓度局部化的困难。为了增加结果的生物学相关性,我们最初在大量HCHO过量的情况下进行了分析,我们在较低的HCHO:AA比和更稀的条件下(AA 25 µM; HCHO 30 µM)与Cys或His进行了反应。尽管稀释浓度和减少的HCHO过量(1:1.16),Cys仍然显示出噻唑烷1的形成。然而,在这些条件下,没有观察到具有His的产物(补充图 12和13)。

评估产品稳定性

然后,我们研究了选定的AA-HCHO加合物的稳定性。首先,在除去残留的过量HCHO后,监测加合物的寿命。这是通过任一实现的:与HCHO清除剂1,3- diketocyclohexane(DCH)(ⅰ)治疗9,或(ii)冷冻干燥,然后再加入d的2 O. AA的反应混合物(4.34毫摩尔)和HCHO (10当量)在去除HCHO之前达到平衡(3-24小时)。将这两种方法中的任一种应用于含有1718的混合物都会在1 h内快速重整His,这意味着这两种加合物会快速降解(补充图 14和15)。同样,恶唑烷快速降解78中观察到,重新成形丝氨酸和苏氨酸分别1小时和4小时内(补充图 16 - 18)。当将含有内酰胺1112(来自Asn和HCHO的反应)和内酰胺1124(来自Arg和HCHO的)的混合物暴露于上述两种方法中时,观察到母体AA的形成明显变慢且不完全(72小时后) ,这表明这些内酰胺(1112)比从His,Ser和苏氨酸得到的环化加成物更稳定(补充图 19 - 22)。处理Trp衍生的2223的混合物DCH显示出N-羟甲基的损失;然而,HCHO衍生的C,N-连接的亚甲基在48小时内稳定(补充图 23)。那些分析(半胱氨酸加合物的最稳定的AA-HCHO加合物1,丝氨酸7,苏氨酸8,天冬酰胺111213,色氨酸212223,精氨酸24)是半胱氨酸衍生的噻唑烷1,这是在整个稳定分析时间(补充图 24)。当13 C标记的HCHO(H 13CHO)添加到噻唑烷1的水溶液中,观察到13 C-标记缓慢掺入1> 48 h),这表明产物1Cys处于缓慢的动态平衡状态(补充图 25)。当Trp衍生的212313 CHO处理16 h时,也观察到13 C标记的掺入(补充图 23B)。在N-羟甲基处发生13 C结合。

半胱氨酸与不同氨基酸之间竞争与HCHO的竞争

然后,我们研究了AA与HCHO反应之间的竞争,最初着眼于在Cys和HCHO反应混合物中添加其他AA的影响。在竞争实验中,向包含Cys和Thr,Hse,Asn,His,Trp,Arg,Lys或Orn(1:1比例)的反应混合物中添加1当量的HCHO,观察到Cys衍生的噻唑烷1的排他性形成12小时内;除His之外,在此期间未观察到其他任何产品(补充图 26 – 34)。最初观察到具有His,NN-环化的17,但该产物在5小时内随着噻唑烷1的形成还原为His 。

然后,我们对三种含硫醇的AA,Cys,Hcy和Pen进行了竞争实验。向Cys,Hcy和Pen(1:1:1,在4.34 mM下)的混合物中加入HCHO(1当量),并使该混合物反应6小时(补充图 35)。衍生自Pen的噻唑烷56小时后的主要产物(占总产物的55%),同时还观察到了Cys衍生的噻唑烷130%)和Hcy衍生的噻嗪烷315%)(补充图。  35)。这些研究表明,在测试条件下,噻唑烷环的形成优于噻嗪烷环的形成,这意味着更快的形成速率和/或稳定性。优先选择5以上1可能是由于Thorpe–Ingold效应。

用含醇的AA,Ser,Thr,allo -Thr和Hse和HCHO(1当量)进行的竞争实验未发现明显形成加合物。过量HCHO(100个当量)的加入导致可观察到的形成苏氨酸衍生的恶唑烷的839%),同种异体-Thr衍生的恶唑烷918%)和HSE衍生恶嗪烷1043%,补充图 36)。没有观察到Ser衍生的恶唑烷7

然后进行了更复杂的AA混合物的竞争实验。将Ser,Thr,allo - Thr,Hse,His,Trp,Asn,Orn,Arg和Lys混合,并与HCHO(1当量)反应24小时。观察到许多HCHO衍生的加合物。的His衍生的加合物17是主要的加合物(29%),而化合物87%),109%),天冬酰胺衍生的1110%),色氨酸衍生的217%)和His-衍生还观察到194%)(一些HCHO未反应,补充图 37和38)。在加入半胱氨酸(1个当量,36小时),加合物的81017从混合物中消失,观察到形成1。然而,加合物111921依然存在,这意味着动力学稳定性(补充图 39和40,注意:当半胱氨酸是在混合物中初始存在的这些加合物没有观察到,见上文)。

然后,我们测试了Cys和HCHO之间的反应速率是否受其他AA的存在影响。在1小时内监测含有Cys(5 mM),HCHO(1当量)和Ala,Ser,Thr或His(10当量)中的一种的混合物(50 mM,pD 7.5)(补充图 41) 。使用Ala或Ser时,仅观察到12。用Thr或His观察到分别形成817。形成的8没有影响的初步形成速率1,而形成的1边加他的速度减慢,大概是作为竞争形成的结果17

上述结果暗示,相对于与HCHO反应,含硫醇的AAS最具活性。为了测试此显然特殊的反应性是否需要Ñ α -氨基,我们反应2三肽,谷胱甘肽,和-δ-(2-氨基己二酰) --cysteinyl- D -缬氨酸(ACV),我们的标准条件下。与先前对谷胱甘肽52的研究相一致,这两个三肽均在中性pH下形成了S-羟甲基化的加合物(补充图 42和43)。

使用不同的亲电试剂比较Cys与HCHO的反应性

然后进行研究以研究其他生物学相关的羰基化合物与Cys的潜在反应。制备的样品含有Cys和乙醛(AcH),丙酮,乙二醛或甲基乙二醛。该反应产生与HCHO(观察到的产物的一组噻唑烷类似的35A35B3637A37B38A38B,图 6)。即使加入碱(NaOD,1当量,36%的56%),Cys与丙酮之间的反应仍不完全形成36%(33%)。与乙二醛反应生成噻唑烷37a在图37b中,中等优选形成反式取代的噻唑烷(37a37b1.1∶1)。即使存在过量的Cys(2当量),也未观察到联氮唑烷的形成。甲基乙二醛反应生成噻唑烷38a38b,再次有利于反式取代38a1.7:1)。

6

image.png

半胱氨酸与醛和酮之间反应的产物。使半胱氨酸(4.34 mM)与非缓冲D 2 O(570 µL)中的醛和酮反应。一个HCHO(10当量); b乙醛(10当量);c丙酮(10当量);d乙二醛(10当量);e甲基乙二醛(10当量);f乙醛(100当量);g丙酮(100当量);h乙二醛(100当量); i甲基乙二醛(100当量); j HCHO(100当量)

全尺寸图片

然后,我们比较了不同亲电试剂的反应性。用每种亲电子试剂(10当量)处理Cys(4.34mM),并使反应反应完成,然后加入HCHO(100当量)。然后评估噻唑烷的相对水平。HCHO从36置换丙酮的速度最快,导致噻唑烷15分钟内完全形成(补充图 44和45)。在一小时内将乙二醛产物37a37b置换为1,而甲基乙二醛产物38a38b在加入HCHO后6小时内,它们在溶液中的存在(补充图 46 – 49)。在5小时内完成乙醛加合物的断裂,得到噻唑烷1(补充图 50和51)。值得注意的是,当反向进行置换反应时,即,将其他亲电试剂(100当量)添加至1的溶液中,未观察到HCHO从噻唑烷1置换。

还原Ñ α -甲基化

尽管我们没有检测到直接证据HCHO和未修饰的AA之间的反应Ñ α标准条件下氨基基团,这种反应可能发生(给定的氨基的亲核性),并且在环状产物的形成潜在中间步骤。此类反应的拟议产物,即半缩醛和亚胺,大概是不稳定/瞬态的,这排除了我们在NMR分析中观察到的结果。因此,我们试图“陷阱” ñ α -反应产物通过公先例还原性N- -甲基化。半胱氨酸,丙氨酸和His分别用HCHO(1个当量)和氰基硼氢化钠(加入NaCNBH混合35个当量,补充图 52 - 54)。值得注意的是,以Ala和His,无论单和二Ñ α我们的水性条件(补充图下甲基化的产物在1个小时内观察到,这表明HCHO和AA之间的反应α氨基发生基团 53和54)。用Cys,Ñ α甲基化的噻唑烷1进行了观察。

预约除甲醛专家→添加微信号:18625155131    了解更多案例



网站首页| 关于境福 | 境福服务 | 境福案例 | 新闻科普 | 留言反馈 | 联系境福

版权所有:室内空气净化工程师 电话:18625155131

地址:南京市中山路178号 技术支持:xx网络 [xx建站] ICP备案编号: 苏ICP备18068306号-1